Nucleic Acids Research

CRISPR碱基编辑器（BE）能在不产生双链断裂的情况下实现C-G→T-A（CBE）和A-T→G-C（ABE）转换，是纠正点突变、构建疾病模型和作物改良的重要工具。近年来，ABE体内编辑PCSK9降低灵长类胆固醇、个体化ABE治疗CPS1缺陷等进展，让碱基编辑从“工具”加速走向“治疗”。

现有CBE/ABE多依赖组成型表达，缺乏外源小分子调控，难以按需启停或切换模式；基因组筛选需在单细胞群体中评估大量核苷酸替换，组成型单一模式编辑器不适用等问题。

吉林大学等单位的研究者在 Nucleic Acids Research发表题为 《Programmable shut-off and mode switching of base editors》的研究论文。围绕碱基编辑器的“可关闭、可切换”问题，开发了基于天然Sddi–Sdd互作的四模式碱基编辑平台ACBE-RTS，并在猴CD163饱和突变筛选中验证了其功能基因组学应用潜力。

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主要研究内容

1. Sddi的鉴定与特异性验证

作者在六种已表征Sdd基因下游均发现编码136–140 aa蛋白的开放阅读框，将其命名为Sddi。六种Sddi均可完全抑制同源Sdd介导的C-to-T编辑。六种Sdd与六种Sddi的全交叉组合实验显示：同源Sddi可将对应Sdd的编辑活性抑制至100%，而非同源组合仍保留至少57.6%的基础编辑活性，表明Sddi-Sdd相互作用具有严格正交性。

2.抑制机制

降解追踪实验排除了Sddi通过促进Sdd降解发挥作用的机制；结构建模与细胞内互补实验表明，Sddi直接结合Sdd并空间遮蔽其DNA结合面，阻止底物进入催化位点。剂量效应实验显示，较低Sddi比例即可将残余编辑活性抑制至很低水平；界面氨基酸突变可减弱或增强Sddi的抑制效果。

3. ACBE-RTS的构建与四模式验证

作者将催化失活的dSviSdd(E153A)和dAir1Sdd(E193A)串联融合至nCas9(D10A)作为锚点；CBE效应模块为SviSddi-SflSdd，由多西环素诱导的Tet-On 3G/TRE3GS控制；ABE效应模块为Air1Sddi-ABE8e，由cumate/CymR系统控制。系统可在四种模式间切换：

在HEK293T细胞四个内源位点，单诱导模式下C-to-T或A-to-G效率最高约43%，双诱导可实现两种编辑并行，不加诱导剂未检测到编辑。

4. CD163饱和突变筛选

作者在稳定表达ACBE-RTS的MARC-145细胞中，使用包含4851条CD163靶向sgRNA和1100条对照sgRNA的慢病毒文库进行三轮池化筛选。细胞经高致病性PRRSV JXA1株感染后，收集存活细胞并进行NGS分析。结果鉴定出猴CD163的四个关键氨基酸，其改变可使PRRSV复制降低100倍以上，并消除可检测的病毒抗原染色。

主要创新点

• 鉴定天然Sddi-Sdd正交蛋白相互作用模块

• 在单一Cas9支架上实现四种编辑模式切换

• 建立双小分子正交诱导的调控系统

• 将多模式碱基编辑应用于池化功能筛选

• 通过CD163筛选验证平台的功能基因组学应用能力

该研究鉴定了高特异性Sddi-Sdd正交模块，并据此构建了可由多西环素和cumate诱导、在OFF/CBE/ABE/ACBE间切换的ACBE-RTS碱基编辑平台，可用于抗病毒靶点发现、复杂性状解析、功能基因组筛选和精准基因治疗等下游应用。

泓迅生物sgRNA文库构建服务

本研究中的慢病毒sgRNA文库构建、生产和转导是CD163池化饱和突变筛选的关键上游环节：构建决定靶向覆盖度和多样性，生产决定文库代表度和可转导性，转导则建立稳定携带sgRNA的池化筛选细胞库。该环节使sgRNA身份、CD163编辑类型与PRRSV抗性表型可关联分析，是三轮筛选鉴定关键氨基酸的前提。

该研究中，sgRNA寡核苷酸池合成由泓迅生物提供。针对同类池化筛选需求，泓迅生物可提供覆盖sgRNA设计、寡核苷酸池合成、载体克隆、慢病毒包装及覆盖度、均一性和滴度质控的全流程慢病毒sgRNA文库构建服务。

• 从sgRNA设计、文库构建到慢病毒包装的一站式服务

• 数十种模式物种，定制化sgRNA设计

• 丰富的sgRNA表达载体，提供转染级质粒

• 覆盖度>99%

• 均一性< 4-10

Reference

[1] Deng J, Zhou J, Xiang H, Li X, Han X, Weng Z, Jia J, Shao Y, Sima Y, Niu M, Li D, Ouyang H, Xu B, Pang D, Yang L, Yuan H. Regulated transformation system (RTS): sddi-mediated programmable shut-off and mode switching of base editors. Nucleic Acids Res. 2026 Mar 19;54(6):gkag162.