在基因治疗与疫苗开发领域，DNA的拓扑结构对其生物学功能具有决定性影响。环状单链DNA（Circular Single-Stranded DNA，CssDNA），又称单链质粒，是一条共价闭合的单链DNA分子。其独特的环状结构赋予其区别于线性DNA和双链DNA的系列物理化学及生物学特性，正逐步成为基因治疗和核酸药物领域的研究热点。

CssDNA与线性DNA的差异

CssDNA与线性单链DNA（lssDNA）的本质区别在于拓扑结构：CssDNA的5'端与3'端通过磷酸二酯键共价连接，形成闭合环状结构；而线性DNA分子具有游离末端。

这一结构差异带来以下关键生物学后果：

1.核酸酶抗性

细胞内外广泛存在的核酸外切酶需从DNA分子末端起始水解。CssDNA因缺乏游离末端，对核酸外切酶表现出天然抗性，其胞内半衰期显著长于线性DNA。线性单链DNA和线性双链DNA在进入细胞后均面临快速的酶降解，这是限制其表达效率的重要因素之一。

2.免疫识别差异

双链DNA，特别是含未甲基化CpG基序的细菌质粒DNA，可被Toll样受体9（TLR9）等模式识别受体识别，激活先天免疫应答。CssDNA因缺乏双链结构和细菌骨架序列，免疫原性显著降低，有利于降低治疗过程中的炎症相关副作用。

3.整合风险

CssDNA在细胞内主要以游离体形式存在，其环状结构不利于与宿主基因组的同源重组或随机整合，理论上降低了插入突变风险。

CssDNA的制备与鉴定-案例分享

CssDNA的体外合成主要依赖酶连接法或模板导向连接，其工艺开发面临多项技术挑战：短链CssDNA（<20 nt）的环化效率受底物弯曲自由能限制，产率较低；长链CssDNA（>1 kb）则易产生分子间多聚体副产物，抑制分子间连接、提高环化特异性是工艺开发的核心难点。以下以泓迅生物50nt环状单链DNA为例，展示环化反应原理及产物鉴定标准。

1.环化反应原理

将50nt线性单链DNA引物（5’端带有磷酸基团，3’端为羟基）作为底物，在连接酶催化下，使5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键，从而实现首尾共价连接，生成环状单链DNA产物。该反应的本质是分子内连接，需在反应体系中严格控制底物浓度和反应条件，以抑制分子间多聚体副产物。

2.质谱鉴定：分子量变化确认环化

环化前线性引物的实测分子量与理论分子量一致；环化后产物的分子量较环化前减少约18 Da。

该差异符合线性DNA成环的化学计量特征——环化过程中脱去一分子水（H₂O，分子量18.015 Da），因此产物分子量相应减少18 Da。该质谱数据为环状结构的形成提供了直接分子量证据。

未环化线性引物质谱图

已环化环状引物质谱图

3.电泳胶分析：纯度和环状构象确认

环化产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物条带单一，环化引物比未环化引物在胶中跑的慢些，符合引物成环特性。

核心优势

1.长效稳定表达

CssDNA的环状结构有效抵御核酸外切酶降解，保障治疗基因或抗原基因在细胞内的长期持续表达。这一特性对于需要长效蛋白替代或持续免疫刺激的治疗场景尤为关键。

2.低免疫原性

与含CpG基序的质粒DNA相比，CssDNA缺乏细菌来源的免疫刺激序列，在体内外引起的炎症反应显著减弱。这一特性降低了重复给药时的不良反应风险，也使其在体内基因递送中具有更好的耐受性。

3.低基因组整合风险

CssDNA以游离体形式存在于细胞核内，不主动整合至宿主基因组，避免了病毒载体和部分双链DNA供体相关的插入突变风险，具有更好的长期安全性。

4.高转染/递送效率

在多种细胞类型中，CssDNA表现出优于线性DNA和部分双链DNA的转染效率。其紧凑的拓扑结构可能有利于跨越细胞膜和核膜屏障，或与递送载体形成更稳定的复合物。

应用前景广阔

CssDNA作为非病毒基因治疗载体，近年来在基因敲入和细胞工程化改造中取得显著进展。

1.基因治疗

非病毒基因书写平台。针对现有基因敲入技术的核心痛点——AAV载体的安全性与包装限制、dsDNA的低效率与高毒性、lssDNA的规模化困难——开发了基于CssDNA的非病毒基因书写平台GATALYST。核心技术突破在于实现了约20 kb大片段CssDNA供体的高效生产，并在iPSC中达到70%的HDR介导敲入效率，在CAR-T和NK细胞等多种治疗相关细胞类型中均验证了高精度和高效率¹。

2.肿瘤治疗

研究发现，CssDNA在多种肿瘤细胞系中的表达效率优于传统质粒，且在肿瘤微环境特征条件（葡萄糖缺乏、谷氨酰胺缺乏、缺氧）下表达进一步增强²，为未来的临床转化开辟了新途径。

3.其他领域

此外，CssDNA在基因表达调控领域可作为可编程元件，实现外源基因的抑制与再激活；在肿瘤免疫治疗中，基于CssDNA的细胞因子递送策略已在动物模型中验证了长效表达与抗肿瘤效果；在疫苗开发方面，CssDNA编码抗原可实现长期稳定表达，有助于诱导持续免疫应答；基于CssDNA的多靶点抗miRNA寡核苷酸也为多基因协同治疗提供了新思路。

泓迅生物——CssDNA合成服务

基于上述环化工艺与质控体系，泓迅生物可提供高质量的CssDNA合成服务，以满足科研及临床前开发的不同需求。

• 高稳定性：CssDNA的闭环结构赋予其对核酸外切酶的抗性，有效抵御细胞内降解，保障外源基因的长期稳定表达。

• 高转染效率：相比线性DNA，CssDNA在多种细胞类型中表现出更高的转染效率，在基因治疗和DNA疫苗开发中具有显著优势。

• 应用范围广：可作为基因表达载体构建、病毒学研究、纳米技术及基因编辑等领域的核心工具，适应多样化的实验场景。

• 定制化服务：提供从序列设计到合成交付的全流程定制化服务，支持多种长度、修饰与纯度规格，满足科研及临床前开发的多样化需求。

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引用文献

1.Xie K, Starzyk J, Majumdar I, Wang J, Rincones K, Tran T, Lee D, Niemi S, Famiglietti J, Suter B, Shan R, Wu H. Efficient non-viral immune cell engineering using circular single-stranded DNA-mediated genomic integration. Nat Biotechnol. 2025 Nov;43(11):1821-1832.

2.Shao D, Wang J, Zou K, Chen Y, Zhang P, Song J. The tumor microenvironment enhances the expression of cssDNA by modulating cell cycle signaling pathways via SKP2. Sci Rep. 2025 Nov 5;15(1):38760.

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