全基因组规模的CRISPR敲除筛选已被广泛应用于识别对癌细胞存活至关重要的“必需基因”，这些基因往往是癌症治疗的候选靶点。

在癌症研究中，“合成致死”（synthetic lethality）策略尤为引人关注：当两个基因（尤其是功能冗余的旁系同源基因）同时失活时细胞死亡，而单独失活任一基因则无影响。单基因CRISPR筛选会系统性地遗漏这类靶点。因此，能够同时敲除两个基因的双向导CRISPR系统成为遗传相互作用筛选的关键工具。

现有双sgRNA 系统核心缺陷

现有双向导系统存在三大核心瓶颈：

1. 克隆繁琐。 传统方法依赖两个独立的Pol III启动子（如人源U6和小鼠U6）分别驱动两个gRNA的表达。整个双向导cassette长度过长，无法作为单条寡核苷酸合成，需要多步克隆，效率低下且易出错。

2. 错误配对率高。 两个gRNA间距常达数百碱基，在PCR扩增（模板切换）和慢病毒生产（重组）过程中，gRNA之间容易发生“串号”，形成非设计的错误配对。在一些方法中，错误配对比例可高达50%。

3. 表达不平衡。 两个启动子的活性存在差异，导致位于不同位置的gRNA编辑效率不一致，增加了实验对照的复杂性。

tRNA间隔子实现一步克隆与精准加工

为解决上述瓶颈，Thomas Burgold 等人在2025年《Nature Communications》上报道了一种基于tRNA间隔子的新一代双向导CRISPR系统。该系统利用细胞内源的tRNA加工机制，在RNA水平上精准释放两个gRNA。

工作原理

系统的核心设计为gRNA1 - tRNA - gRNA2的单一转录单元。转录完成后，细胞内高丰度且高效的tRNA加工酶——RNase P和RNase Z——分别识别并切割tRNA的5'端和3'端。这一切割极其精准，不留下任何多余碱基，且加工过程发生在细胞核内——正是gRNA需要发挥作用的位置。

这一设计的关键优势在于：整个双向导cassette仅193个碱基对，加上克隆接头后也仅244 bp。如此之短的长度使得整个构建体可以作为单条寡核苷酸进行化学合成，从而实现一步克隆——通过Gibson组装或Golden Gate克隆即可将gRNA对文库插入任何现有的gRNA表达载体。

关键优化

研究团队对系统进行了系统性的工程优化：

• 前导序列优化。研究发现30 nt的tRNA前导序列可缩短至6 nt而不影响编辑效率（89-96%），但完全移除则导致活性部分丧失（70%）。

• gRNA骨架改造。 团队测试了三种不同的gRNA骨架——野生型（WT）、Mod6和Mod7。Mod7在野生型基础上引入了多处突变以改变序列但维持二级结构，其优势在于：

（1）移除了Pol III转录终止信号（TTTT序列），改善含多聚T的gRNA的表达；

（2）与位置2的骨架序列差异更大，进一步降低了分子间重组的风险。

技术验证：从文库构建到功能筛选

1. 文库构建质量

构建先导（8,914对）和大规模（100,136对）文库。先导文库Gini系数0.19，优于同类文库。大规模文库克隆后正确配对率88.8%，错误配对率仅1.95%，慢病毒生产后升至3.82–5.03%，双端测序可明确归属，不影响精度。

2. 筛选性能

必基因显著耗竭（Cohen's D=2.05），基因效应与单gRNA筛选高度相关（R²=0.81），位置活性平衡（R=0.92），必需基因召回率AUC达0.98–1.0。

3. 生物学发现

识别出旁系同源对（CNOT7/8、ASF1A/B等）、通路互作（BRAF-EGFR）及BCL2L1/MCL1等合成致死组合，并经独立实验验证。

技术优势的系统性总结

与现有双向导系统相比，本技术的核心优势可归纳为：

应用前景与意义

这项技术不仅是一个工具，更是一个平台，具有广阔的应用空间：

1.大规模遗传相互作用图谱：使得在人类细胞中系统性地绘制“合成致死”网络成为可能，为精准肿瘤学提供海量候选药物靶点。

2.组合疗法发现：直接指导针对特定肿瘤突变背景的联合用药策略开发。

3.多功能拓展：

• 提高单基因敲除效率：用两个gRNA同时靶向一个基因，构建“超级迷你文库”。

• 增强CRISPR激活/抑制：用于更高效的上调或下调基因表达。

• 单细胞和光学筛选：双gRNA系统能提高在单细胞测序或成像筛选中检测到gRNA的灵敏度。

• 非编码区功能研究：用于筛选功能性非编码DNA区域。

泓迅生物——双 sgRNA 文库一站式服务上线

泓迅生物推出新一代双sgRNA文库的构建与筛选服务，覆盖从靶点设计、oligo合成、一步克隆文库构建、慢病毒包装、细胞筛选到测序数据分析全链条交付，一站式解决大规模遗传互作筛选技术难题。

✅ 标准化tRNA双向导骨架设计

✅一步快速克隆，交付周期短

✅超低重组文库构建工艺

✅全套配套筛选与数据分析方案

如您有双sgRNA文库设计或遗传相互作用筛选的需求，欢迎进一步沟通交流。

参考文献

[1] Burgold T, Karakoc E, Gonçalves E, Barrio-Hernandez I, Dwane L, Silva R, Souster E, Sharma M, Beck A, Koh GCC, Zalmas LP, Garnett MJ, Bassett AR. A next-generation dual guide CRISPR system for genetic interaction library screening. Nat Commun. 2025 Dec 6;17(1):561.