抗体是生物医学研究的重要工具，而获得其准确的氨基酸序列则是抗体工程和应用的基础。随着质谱技术的飞速发展，抗体测序已从传统方法迈入高精度、高通量的新时代。本文将通过一个真实的鼠单抗测序案例，带你了解质谱技术在抗体测序中的应用。

为什么抗体测序至关重要？

抗体（免疫球蛋白）是免疫系统用来识别和中和外来物质的关键蛋白质。测定抗体的基因序列或氨基酸序列，对于开发新型疫苗、研制治疗性抗体药物、理解免疫应答机制具有核心意义。

通过抗体测序，科学家可以：

• 揭示抗体的结合特性和特异性；

• 追踪免疫应答中的抗体进化过程；

• 在临床诊断中识别自身免疫抗体；

• 为个性化医疗提供支持。

蛋白质测序技术演进与方法学比较

蛋白质一级结构测定主要包括多肽链数目确定及氨基酸顺序分析。传统方法与现代质谱技术在原理与应用场景上存在显著差异。

1.Edman 降解化学测序

Edman 降解自 1950 年代建立以来，长期作为蛋白质 N 端序列测定的金标准方法。其原理基于苯异硫氰酸酯（PITC）与 N 端氨基反应，形成苯氨基硫甲酰基衍生物，在酸性条件下裂解为噻唑啉酮衍生物，经异构化为稳定的苯乙内酰硫脲氨基酸，通过色谱鉴定。

技术特征：

• 单次测序长度：通常10-15个氨基酸残基

• 检测灵敏度：皮摩尔（pmol）级别

• 优势：不依赖数据库，结果直观可靠

• 局限：无法分析N端封闭修饰，通量低，样品消耗大

2.基于质谱的从头测序

质谱技术的应用突破了传统方法的局限。从头测序（de novosequencing） 无需借助任何蛋白质或 DNA 数据库信息，直接通过串联质谱碎片离子推导序列，特别适用于未知蛋白、突变体及物种特异性抗体的分析。

技术优势：

• 灵敏度：可达阿摩尔（amol）级别

• 序列覆盖率：可实现全长覆盖

• 修饰解析：可同时鉴定磷酸化、糖基化等翻译后修饰

• 适用对象：多肽、单抗、多抗、重组蛋白等各类样本

3.重组 DNA 技术

通过克隆抗体对应基因序列，从 DNA 层面推导氨基酸序列。该方法依赖杂交瘤细胞或外周血B细胞，且无法提供蛋白质水平的翻译后修饰信息。

其中，质谱法因其高灵敏度、高速度和高准确性，已成为抗体蛋白测序的主流选择。

质谱技术如何攻克抗体测序难点？

抗体分子量巨大（约 150 kDa），且由轻链和重链组成，传统 Edman 降解只能测 N 端几十个氨基酸，且无法处理复杂混合物。而质谱技术的进步，特别是高分辨率质谱仪和多种碎裂技术（如 ETD、HCD）的应用，使得全序列覆盖成为可能。

关键挑战与解决方案：

• 序列全覆盖：采用多种蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等）进行酶切，产生重叠肽段，确保每个氨基酸都被覆盖。

• 区分亮氨酸（L）和异亮氨酸（I）：两者分子量相同，传统质谱难以区分。通过 ETD（电子转移解离） 碎裂技术结合数据库比对，可以明确区分。

• 翻译后修饰解析：如 N-糖基化、焦谷氨酸修饰、C 端缺失等，需要结合完整分子量验证和质谱碎片分析。

案例分享：Ty1标签单克隆抗体质谱测序

我们以最近完成的项目为例，系统展示 Ty1 标签单克隆抗体（BB2）的质谱从头测序全流程。该抗体为 Mus IgG1 亚型，其完整序列的精确解析对于验证抗体分子结构、支持后续功能研究及应用开发具有重要意义。

实验方法

1.蛋白酶水解

多酶切：将抗体分为6份，分别用胰蛋白酶、溶菌酶C、糜蛋白酶、胃蛋白酶、WaLP、弹性蛋白酶消化，产生重叠肽段。

2.质谱检测

采用Dionex Ultimate 3000 RSLCnano高效液相色谱分离肽段，Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪采集数据（配备ETD）。

3.序列确认

通过测序软件进行抗体序列拼接；

通过质谱ETD离子、酶切位点及数据库比对区分亮氨酸与异亮氨酸；

获取抗体轻链与重链的氨基酸序列。

结果分析

1.Ty1标签单克隆抗体（BB2）轻链

2.Ty1标签单克隆抗体（BB2）重链

3.完整分子量验证

还原去糖基化后，测定轻链和重链分子量：

• 轻链理论值与实测值误差仅0.20 Da。

• 重链理论值与实测值误差仅1.09 Da。分析发现C端缺失一个赖氨酸（K），N端谷氨酰胺（Q）发生焦谷氨酸修饰，且去糖后N端天冬酰胺（N）转变为天冬氨酸（D），校正后与实测高度吻合。

4.区分亮氨酸与异亮氨酸

通过ETD碎片图谱，明确区分了序列中的L和I，确保了序列的准确性。

Ty1标签单克隆抗体重链中氨基酸I与L的差异图谱

泓迅生物抗体测序服务

基于高精度、高分辨率质谱设备，结合自主研发的测序技术平台，能够实现对抗体氨基酸序列的精准解读。同时，我们有高通量表达验证平台，能够对已测得的抗体序列进行高通量表达验证，从而保证交付抗体的活性。

• 保证测序准确度100%

• （轻链测序误差范围+/- 1.2Da；重链测序误差范围+/- 1.8Da）

• 保证VJC、DVJC区域 100%覆盖

• 保证交付抗体活性

• 仅需 100μg 纯化抗体

抗体测序是抗体工程的关键环节，也是生物医药研发的基石。泓迅生物致力于以一流的技术平台和专业的团队，为全球客户提供高质量的抗体测序服务。无论您需要验证单抗序列、发现新抗体，还是解析修饰信息，我们都能为您提供精准的解决方案。

如果您有抗体测序需求，欢迎联系我们，共同探索蛋白质序列的奥秘！

为什么选择泓迅

领先的技术优势—AI密码子优化分析（专利技术）

成熟的蛋白表达经验——五大蛋白表达系统，自主研发数十种高效表达载体

更高的价值服务—合成生物学一站式解决方案