在分子诊断与基因分析领域，实时荧光定量 PCR 技术的精准度与可靠性直接影响着实验结果的科学价值。作为该技术的核心元件，荧光探针的质量优劣往往决定着实验的成败。本文将系统解析荧光探针设计与应用中的关键技术要点，并分享最新的优化实践。

qPCR 检测方法

荧光染料法的原理与局限性

SYBR Green 染料法作为最经典的 qPCR 检测方法，其工作机制基于染料分子特异性地嵌入双链 DNA 的小沟区域。当受到激发光照射时，这些嵌入的染料分子会发出强烈的荧光信号，其强度与体系中双链 DNA 的含量成正比。这种方法的主要优势在于其经济性和通用性：探针设计相对简单，成本较低，且适用于快速初筛实验。

然而，SYBR Green 法的局限性同样明显。由于其与所有双链 DNA 非特异性结合的特性，包括引物二聚体、非特异性扩增产物等都会产生荧光信号，导致假阳性结果的出现。此外，该方法无法区分特异性产物和非特异性产物，其检测特异性完全依赖于引物设计的质量和反应条件的优化。

探针法的技术优势

TaqMan 探针法通过引入特异性荧光标记探针，实现了对目标序列的特异性检测。该技术的核心在于探针设计与作用机制：探针序列与目标 DNA 特异性结合，位置位于上下游引物之间；5'端标记荧光报告基团（如 FAM、VIC），3'端标记淬灭基团；在 PCR 扩增过程中，Taq 酶的5'→3'外切酶活性切割探针，使报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。

与 SYBR Green 法相比，探针法具有显著优势：

• 特异性更高：仅检测特定目标序列

• 灵敏度更优：可检测低至10拷贝的目标分子

• 多重检测能力：支持4-6个通道同步检测

• 背景信号更低：特异性荧光释放机制减少非特异性信号

关键的 qPCR 探针技术

目前主要的 qPCR 探针技术主要有以下几种：

• TaqMan 探针

最具代表性的 qPCR 探针。利用 Taq 酶的外切酶活性切割探针，使报告基团与淬灭基团分离而产生荧光，特异性高、应用最广。

• 分子信标

采用茎环结构，与靶序列结合后构象改变而发光，对单碱基突变敏感，适用于 SNP 检测。

• MGB 探针

在 TaqMan 基础上引入小沟结合物，可设计更短探针以提高特异性和结合力，利于区分单碱基差异。

• 双杂交探针

依赖两条相邻探针间的 FRET 产生信号，放宽了对单一探针长度的限制。

了解了几种主要的探针类型后，我们将聚焦于最主流的 TaqMan 探针技术。若要充分发挥其多重检测的优势，深入理解其关键的荧光报告基团与相应的检测通道至关重要。

荧光通道的特性

在 Taqman 探针法中，我们检测的是荧光信号的累积。qPCR 仪通过不同荧光通道区分多个靶标，常见的报告基团包括：

• FAM：发射波长约518 nm，适用于低丰度靶标，灵敏度高。

• VIC：发射波长约552 nm，绿色荧光，稳定性佳。

• FXP：发射波长约592 nm，红色荧光，常用于中通量检测。

• CY5：发射波长约667 nm，远红色荧光，易受仪器检测灵敏度限制。

多通道检测的设计要点

探针的发射光谱不应重叠，且需匹配仪器的检测能力。

引物与探针的 Tm 值应协调：探针 Tm 值需比引物高5–10℃，通常控制在65–70℃。

避免使用G 碱基作为探针5′端第一个碱基，因其可淬灭报告基团荧光。

不均一性的影响与优化必要性

遵循以上这些设计要点是成功进行多重检测的基础，但一个无法回避的核心问题是荧光通道本身的信号不均一性，这直接关系到定量结果的真实性与可靠性。

1.信号差异对结果的影响

• 定量偏差：强信号通道（如 FAM ）可能掩盖弱信号通道（如CY5）的低丰度靶标，导致假阴性。

• 扩增效率不一致：各通道扩增效率偏离理想范围（90–110%），影响基因表达比较的准确性。

• 数据可信度下降：通道间CV值超过10%时，重复性显著降低。

2.信号均一化的优势与效果

• 数据质量显著提升：

各检测靶标的 Ct 值标准差减小，实验的重复性和精密度极大提高。

多重反应中，各靶标的扩增效率高度一致，确保了定量的准确性，使不同基因间的表达量比较更具可比性。

有效的信号均衡和串扰抑制，有助于获得更宽的线性检测范围。

• 检测灵敏度与可靠性增强：

弱表达靶标的检出率提升。

整体信噪比提升，使得低拷贝数模板的检测更加可靠。

• 操作流程简化与效率提升：

使用者无需进行繁琐的通道间标准化或预实验来调整探针浓度以平衡信号。

减少了因信号不均一导致的重复实验，数据分析也更快捷。

3.应用前景

精准医疗与伴随诊断：例如，在肿瘤领域，可实现 EGFR、KRAS、NRAS、BRAF 等重要基因突变的同步定量检测，对突变丰度的检测灵敏度提高，助力靶向用药指导。

多病原体联检：在呼吸道感染诊断中，可一次性高效精准检测COVID-19、甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒等多种病原体，提升诊断效率。

基因表达与功能研究：在生命科学研究中，例如干细胞分化研究，可同步精准定量OCT4、SOX2、NANOG、LIN28A等多个多能性基因的表达动态，深入解析基因调控网络。

泓迅生物：qPCR探针技术的革新者

在深入分析荧光探针技术所面临的关键挑战后，泓迅生物依托扎实的技术积累与大量实验验证，推出了全新的qPCR探针优化解决方案。该方案通过对探针序列设计、荧光标记化学体系及反应条件等方面的系统性优化：

有效降低了高信号通道的本底荧光强度

同时提升了低信号通道的荧光信号输出

最终，各荧光通道的信号强度被调控至相近水平，成功实现了多重qPCR中不同荧光通道信号的高度均一化，为高精度、多靶标核酸检测提供了可靠的技术支持。

基于这些技术创新，所有泓迅生物的qPCR探针服务都将全面采用优化后的新技术体系。

检测性能显著提升的探针产品，各荧光通道信号均一性得到根本改善；

实验数据可靠性大幅增强，有效降低重复实验频次，节约研究成本和时间；

完善的技术支持服务，从探针设计到实验优化的全流程专业指导。

限时特惠

即日起至11月30日 qPCR 探针相关服务享受6折特惠。活动期间，您不仅可以以更优惠的价格获得我们最新优化的探针产品，还能享受专业的技术咨询服务和实验方案优化指导。

2025 为什么选择泓迅

领先的技术优势—AI赋能的合成生物学技术

更高的价值服务—一站式合成生物学解决方案