RNA干扰——shRNA

RNA干扰（RNAi）是细胞内一种高度保守的序列特异性基因沉默机制。短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）是一种经由载体递送并稳定表达的RNA分子，其可在细胞内被加工成小干扰RNA（siRNA），进而引导RNA诱导沉默复合物（RISC）降解靶信使RNA（mRNA），从而实现特异性基因敲低。

Gene silencing by RNAi [1]

为超越单一基因功能研究，实现对复杂生物学过程的系统性解析，shRNA 文库技术应运而生。

1. 什么是shRNA文库

单个 shRNA 实验只能研究一个特定基因的功能。然而，生物学中的绝大多数现象（如细胞增殖、死亡、分化、癌症发生、药物反应等）都不是由单个基因决定的，而是由复杂的基因网络共同调控的。因此，要全面理解这些过程，就需要一种能够同时、系统地干扰大量基因并进行筛选的方法。shRNA 文库正是为了满足这种高通量筛选的需求而诞生的。

shRNA 文库是一个经过严谨生物信息学设计的、包含数万条独特 shRNA 序列的重组慢病毒载体集合。该文库旨在靶向基因组中几乎所有编码基因，每条 shRNA 序列针对一个特定基因的转录本。通过高通量病毒包装和生产，可获得滴度均一、覆盖完整的病毒文库池，用于大规模细胞转换。2

2. shRNA文库的主要作用

大规模功能丧失性筛选这是shRNA文库最核心、最强大的应用。科学家可以利用文库在细胞水平上回答这样一个问题：“成千上万个基因中，哪些基因的沉默会导致我感兴趣的特定表型？”

工作原理：

建库与转换：将一个包含数万条shRNA序列的病毒文库感染到大量细胞中，确保每个细胞只随机接收1-2条shRNA，从而形成一个“每个基因都被不同程度沉默”的细胞群体。

施加选择压力：给这个细胞群体施加特定的选择条件。

正向筛选：例如，在培养皿中加入一种抗癌药物，那么那些因某个基因被沉默而存活下来（获得耐药性）或快速增殖的细胞就会被富集。

负向筛选：例如，寻找对细胞存活至关重要的基因，那些因必需基因被沉默而死亡或消失的细胞会被淘汰，它们在筛选前的群体中含量很高，在筛选后的群体中含量极低。

测序与比对：筛选结束后，提取存活细胞群的基因组DNA，通过高通量测序技术分析其中shRNA的序列和丰度。

数据分析：通过与筛选前的原始文库比对，找出那些在存活细胞中被显著富集或被显著耗尽的shRNA。这些shRNA所靶向的基因，就与我们所研究的表型（如耐药性、细胞存活）密切相关。

Generation of a pooled shRNA library for functional genomics screens [2]

shRNA文库的应用领域

01. 发现新的药物靶点或疾病相关基因

• 癌症研究：筛选哪些基因的沉默可以使癌细胞对化疗药物更敏感，这些基因本身可能就是很好的药物靶点（如果抑制该蛋白能增强药效）。
• 病毒感染：筛选宿主细胞中哪些基因是病毒复制所必需的，为开发抗病毒药物提供新思路。
• 疾病机理：筛选在特定疾病模型（如神经退行、代谢疾病）中起关键作用的基因，揭示新的疾病机制。

02. 合成致死筛选

这是癌症治疗中的一个重要概念：两个基因单独突变都不会导致细胞死亡，但同时突变则会导致细胞死亡。shRNA文库可以用于筛选与已知癌基因（如KRAS, MYC）构成“合成致死”关系的其他基因。这意味着，对于携带特定癌基因突变的癌症，我们可以设计药物来靶向与其合成致死的另一个基因，从而特异性杀死癌细胞而不伤害正常细胞。

03. 验证基因功能网络

通过分析筛选结果中富集或耗尽的基因集合，可以进行生物信息学分析（如通路富集分析），发现这些基因主要参与哪些生物学通路（如MAPK信号通路、细胞凋亡通路等），从而从系统层面理解调控某一表型的基因功能网络。

shRNA文库的优势与特点

• 高通量：一次实验可筛选数万个基因，效率极高。
• 系统性：无偏见地探索整个基因组，有可能发现之前未被注意到的基因。
• 功能直接：直接揭示基因的功能缺失所带来的表型，建立“基因-表型”的直接因果关系。
• 永久沉默：shRNA通过载体整合到基因组中，可以实现长期的基因沉默，适用于需要长时间培养的筛选实验。

建立shRNA文库的根本原因是生物学问题的复杂性，其核心作用是将RNAi技术转化为一种强大的大规模发现工具。它使科学家能够像进行“人口普查”一样，在全基因组范围内快速、系统地筛选出与特定生命现象或疾病过程相关的关键基因，从而极大地加速了功能基因组学的研究和新药靶点的发现。

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Reference

[1] Mohr SE, Smith JA, Shamu CE, Neumüller RA, Perrimon N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Sep;15(9):591-600.

[2] Papadopoulos D, Ade CP, Eilers M. Generation of a pooled shRNA library for functional genomics screens. STAR Protoc. 2022 Feb 15;3(1):101183.