CRISPR基因编辑技术正驱动着生命科学研究的革命性进展，而其高通量筛选能力—CRISPR文库筛选更是解锁基因功能的强大“优化器”。然而，构建高质量、高保真的sgRNA文库，是整个筛选流程成败的关键第一步。本文将聚焦这一核心环节，介绍Oligo Pools技术为CRISPR文库构建带来的质控升级，并赋能更广泛的科研应用。

CRISPR-Cas9基因编辑技术

诞生于2012年的CRISPR基因编辑技术，可能是21世纪以来生命科学领域最受关注的科学突破。2020年，CRISPR基因编辑技术获得诺贝尔奖的认可，而在2023年12月，美国FDA批准了首款基于CRISPR的基因编辑疗法上市，用于治疗镰状细胞病（SCD）。

CRISPR-Cas9技术凭借其精准编辑、操作便捷的特性，已成为生命科学领域的革命性工具。当前研究热点聚焦于全基因组规模的功能筛选—通过一次性敲除/激活数万个基因，系统性解析肿瘤耐药性、免疫逃逸、罕见病靶点等关键机制。

CRISPR文库筛选

CRISPR文库筛选是CRISPR/Cas9技术的一种应用。sgRNA的crRNA部分是可定制的组件，可在每个CRISPR实验中实现特异性。利用CRISPR/Cas9技术建立目标物种的全基因组敲除库或与特定功能相关的基因敲除库，通过功能性筛选和富集及后续PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为sgRNA文库筛选。

文库筛选流程

在构建CRISPR筛选文库的核心流程中，核心组件sgRNA（向导RNA）如同“基因导航仪”，其设计质量直接决定筛选成败。Oligo Pools（寡核苷酸池）技术作为高通量合成平台，严格把关sgRNA序列的覆盖度、均一性与精准度，因此Oligo Pools技术被视为质控升级的关键环节。

关键挑战：Oligo Pools 的合成质量

传统引物合成成本高，时间长、效率低。引物池（Oligo Pools）是一种由大量寡核苷酸序列组成的混合溶液，高通量，序列覆盖率高，并且均一性好。那么，oligo pools合成的准确性是如何影响CRISPR文库筛选的最终结果呢？

1. Oligo Pools合成错误率对下游质粒的影响：

覆盖度降低：高错误率下，有效（正确）单克隆比例低，导致实际有效深度远低于预期。低频sgRNA更容易丢失，无法被检测到。

均一性变差：高错误率导致文库中错误分子比例增加。这些错误分子挤占了正确分子的份额，尤其使低频正确分子的实际拷贝数更低甚至丢失。

后果：不同sgRNA之间的丰度差异变大，平衡性被破坏，影响筛选结果的解读。

2. 高错误率的文库质粒对病毒包装的影响

大规模基因功能筛选下游一般会选用慢病毒，而如果oligo pools文库的正确率比例偏低，也会影响到病毒颗粒中包含预期sgRNA占总病毒颗粒的比例。

3. 高错误率的文库质粒对筛选结果的影响

非特异性打靶（假阳性/假阴性干扰）

错误的sgRNA随文库进入细胞，可能靶向非目标基因组位点。

降低目标sgRNA的有效深度

错误的sgRNA占用感染名额，导致实际进入细胞的 正确sgRNA数量显著低于预期。深度不足会降低低频sgRNA的检测灵敏度，影响统计效力。

错误率的影响会从文库构建→病毒包装→细胞感染→测序分析 逐级传递，形成"错误累积效应"。因此，使用低错误率oligo pools是构建高质量、高可信度CRISPR筛选文库的关键前提，对基因合成还能大幅降低成本、提高效率。

Oligo Pools：多学科研究的“合成引擎”

Oligo pools技术通过高通量、高精度合成sgRNA文库，为功能基因组筛选、药物靶点发现、疾病机制解析、基因治疗优化及合成生物学回路构建等关键CRISPR应用领域提供核心支撑。除此以外，Oligo pools更凭借大规模并行合成、高序列覆盖度的核心优势，成为多领域研究的通用引擎：

突变体库构建

通过Oligo Pools，研究人员能够合成大量含有不同突变的DNA片段，从而创建突变体库，用于筛选出具备优异功能的蛋白质或基因调控序列。

NGS杂交捕获探针文库

NGS建库时，通过Oligo Pools合成构建杂交捕获探针文库，既可以用于目的基因的捕获与检测,也可以用于筛选靶序列的特异性探针序列。

荧光原位杂交（FISH）

Oligo Pools通过高通量合成，在短时间内生成大量的具有不同序列的探针，可以覆盖目标区域的多个位点，提高FISH检测的灵敏度和准确性。

合成生物学和DNA数据储存

在合成生物学中，研究人员可以通过Oligo Pools合成DNA片段，并利用DNA拼接技术将其组装成更大的DNA结构，快速实现多基因合成或途径优化。此外，随着DNA储存技术的发展，Oligo Pools的高通量合成能力使其成为DNA数据存储的理想解决方案。

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