酵母表达系统是真核表达系统中应用最广泛的之一，其中巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii，又名Pichia pastoris）作为甲基营养型酵母的代表，近年来发展迅速，应用广泛。

毕赤酵母：基因表达的新纪元

毕赤酵母表达系统诞生于上世纪80 年代初期，它融合了原核表达系统与真核表达系统的诸多优点，迅速在众多表达系统中脱颖而出。与原核表达系统相比，它不仅保留了操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等特性，还具备原核生物所欠缺的对外源蛋白的翻译后修饰能力，如糖基化、蛋白磷酸化等，使表达的重组蛋白更接近天然产物。同时，它又克服了酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不稳定、表达质粒易丢失等缺陷，成为外源蛋白表达的理想选择。

毕赤酵母表达系统的主要优势

1. 高效AOX1启动子：目前最强、调控机制最严谨的启动子之一，便于调控外源基因的表达。

2. 蛋白加工修饰功能：可对表达的外源蛋白进行糖基化、磷酸化、脂类酰化等翻译后修饰，使重组蛋白与天然产物更相似。

3. 低成本与高效生长：菌株生长迅速，培养基成本低廉，培养条件简单。

4. 高表达量：外源蛋白表达量高，支持胞内和分泌表达。

5. 基因稳定整合：外源基因能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝形式稳定整合，可稳定遗传50代以上。

6. 高密度发酵：耐受高密度发酵，便于工业化生产。

P. pastoris生产重组蛋白的流程

毕赤酵母菌株多样性

当前所采用的巴斯德毕赤酵母菌株都源自原始的Y-11430菌，常用的有GS115、KM71、X33和SMD1168等。蛋白胞内表达优先选MutS表型，分泌表达Mut + 和MutS均可；多数菌株如SMD1168、GS115、KM-71是组氨酸脱氢酶缺陷型，可用不含组氨酸培养基筛选重组子，且SMD1168为蛋白酶缺陷型，适合表达不稳定蛋白质或蛋白质复合物以避免内源性蛋白酶降解。但SMD1168菌株生长缓慢，导致蛋白质产量低

毕赤酵母常用表达载体

毕赤酵母表达载体分为分泌型和非分泌型两大类，分别适用于不同类型的蛋白质生产需求，其中分泌型载体利用酿酒酵母的分泌信号序列，有效引导外源蛋白的分泌，提高了蛋白的产量和纯度。因此，深入了解和优化毕赤酵母表达载体，对于提升蛋白生产效率和质量至关重要，也是当前生物技术和基因工程研究中的热点之一。

常见的用于生产分泌蛋白的毕赤酵母表达载体【1】

常见的用于生产胞内蛋白的毕赤酵母表达载体【1】

毕赤酵母基因改造技术

1. 基于线性化质粒载体的同源重组

同源重组技术是一种利用生物体自身修复机制的基因工程技术。在毕赤酵母中，通过将线性化的质粒载体引入，可以高效地将外源基因整合到宿主基因组的特定位点。这一过程依赖于同源臂序列，这些序列与目标基因组区域具有高度相似性，从而促进了质粒载体与宿主DNA之间的重组。这种方法的优势在于其操作简便、整合效率高，可以实现外源基因的多拷贝插入，这对于提高基因表达水平和蛋白质产量至关重要。在工业生产中，这种技术常被用于优化基因表达，以满足生物制药和工业酶生产的需求。此外，同源重组技术还可以用于基因功能研究、疾病模型构建以及生物技术产品的开发。

2. 基于CRISPR/Cas9的基因编辑

CRISPR/Cas9系统是一种革命性的基因编辑技术，它通过利用指导RNA（gRNA）引导核酸酶Cas9精确切割目标DNA序列。这种特异性的切割触发了细胞内的修复机制，包括非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），从而实现基因的敲除、插入或替换。CRISPR/Cas9技术以其高效性和精准性在基因组编辑领域占据重要地位，特别适用于复杂代谢途径的优化和多基因编辑。在毕赤酵母中，CRISPR/Cas9技术已被广泛应用于基因功能研究、菌株改良以及生产性能的提升。例如，通过敲除或替换特定基因，可以增强宿主菌的蛋白质表达能力或改变其代谢特性，以适应特定的工业生产需求。

3. 基于CRISPR/Cas12的基因编辑

CRISPR/Cas12系统，也称为Cpf1，是CRISPR家族中的另一种基因编辑工具。Cas12蛋白具有广泛的靶向能力和单链DNA切割特性，使其在基因组编辑中具有独特的优势。与Cas9相比，Cas12对靶位点的PAM（原始间隔短回文重复序列）依赖性更宽松，这为基因编辑提供了更大的灵活性。CRISPR/Cas12系统在表观遗传调控和新型生物技术的开发中展现出巨大潜力，例如，它可以用于研究基因沉默、激活以及DNA甲基化等表观遗传修饰。此外，Cas12的单链切割特性使其在开发新型核酸检测技术、基因治疗策略以及合成生物学应用中具有独特的应用前景。在毕赤酵母中，CRISPR/Cas12技术的应用还相对较新，但已有研究表明，它在基因组编辑和基因功能研究中具有巨大的潜力。

毕赤酵母创新突破

经过几十年的广泛应用，毕赤酵母表达系统已成功表达了数以千计的异源蛋白，其中大部分为医药制品。美国FDA 对该系统的认可，如 Cephelon 制剂的获批，充分证明了其安全性和有效性。在我国，虽然目前上市的基因工程药物大多源于大肠杆菌原核表达系统，但毕赤酵母表达系统凭借其国际上的广泛认可，必将在未来的医药市场中占据重要地位。

泓迅生物

酵母基因编辑 & 重组蛋白表达平台

泓迅生物利用CRISPR等新技术，实现了对毕赤酵母基因组的精准编辑，包括基因敲除、插入和替换。我们成功敲除了GS115菌株的KU70基因，显著提高了毕赤酵母的重组效率和外源基因的整合频率，同时敲除了pep4基因，降低了外源蛋白被降解的风险。

我们深耕合成生物学领域，拥有丰富的基因合成、重组蛋白表达和基因编辑经验。我们提供一站式解决方案，帮助解决毕赤酵母蛋白表达和基因改造的需求，最大限度缩短研发周期。

》案例展示

通过对毕赤酵母GS115的基因改造，提高了菌株对外源蛋白的表达和分泌。并利用该重组菌株成功表达了多个人源重组蛋白的高效分泌表达，培养液中杂蛋白很少，产量预计可达10g/L。

》免费样品测试

· 可免费提供少量蛋白样品以供测试。

· 菌株、蛋白等相关信息可联系本司咨询。

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未来展望

毕赤酵母表达系统以其高表达、高密度、多样化翻译后修饰以及无内毒素和病毒的安全性等优势，成为重组蛋白表达的优选平台。CRISPR/Cas9等基因组编辑技术的应用将进一步推动该系统的发展，助力重组人源蛋白在生物医药、美容护肤等领域的研究和应用。

重组胶原蛋白基因的选择和设计、表达条件的优化和验证对于获得高产量的蛋白至关重要。泓迅生物提供从“序列优化”到“基因合成”到“重组胶原蛋白表达”一站式服务。高效的基因合成、多种表达体系协助您在实验室低成本无限合成，提高胶原蛋白的表达量、亲水性和可加工性，创造更多应用可能。

参考文献

[1] Karbalaei M, Rezaee S A, Farsiani H. Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins[J]. Journal of cellular physiology, 2020, 235(9): 5867-5881.

[2] De S, Mattanovich D, Ferrer P, Gasser B. Established tools and emerging trends for the production of recombinant proteins and metabolites in Pichia pastoris. Essays Biochem. 2021 Jul 26;65(2):293-307.

[3] Cos, O. et al. (2006). Microbial Cell Factories, 5, 1-20.
[4] Staley, C. A. et al. (2012). Gene, 496(2), 118-127.
[5]覃晓琳et al. (2010).生物技术, 20(3), 4.
[6]周则迅&袁汉英. (2000).复旦学报:自然科学版(3), 264-268.
[7] Siegel, R. S. & Brierley, R. A. (1989). Biotechnology and bioengineering, 34(3), 403-404.
[8] Liu, Q. et al. (2019). Microbial cell factories, 18, 1-11.